2019, Vol. 27
表1(Table 1)
西瓜[Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum. et Nakai]为葫芦科(Cucurbitaceae)一年生蔓生藤本植物, 在宁夏中卫市环香山地区是一种重要的经济作物。该地区主要采用一种特有的保温、保水、保墒的旱作农业种植模式——沙地上压砂石进行农业耕作, 种出的西瓜富含硒等微量元素, 因此得名“硒砂瓜”。近年来, 由于西瓜枯萎病导致西瓜连作障碍严重, 严重影响硒砂瓜产量和品质。因此, 采用合理有效的微生物学方法进行硒砂瓜连作障碍的防治具有重要意义。
真菌是土壤微生物的重要组成部分之一, 对土壤中生物化学物质的循环及土传病害的监测等起着不可替代的驱动作用[1], 同时也会引起70%~80%的植物病害[2]。作物在长期种植过程中, 由于管理与种植方式相同, 为土壤微生物提供了相同的微生态环境, 定向地影响土壤微生物的生长繁殖, 使得土壤微生物多样性降低, 土传病害增加, 土壤微生物活力下降[3], 微生物结构组成失衡[4]。有研究表明, 作物长期种植所导致的土壤真菌群落结构改变是导致土壤连作障碍的主要原因[5-6]。西瓜枯萎病是西瓜连作过程中最为严重的真菌病害, 其病原菌主要为镰刀菌属的尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusarium oxysporum f. sp. niveum)[7]、腐皮镰刀菌葫芦专化型(F. solani f. sp. cu-curbitae)[8]等, 会导致西瓜产量降低和品质下降[9]。
硒砂瓜连作严重影响宁夏地区硒砂瓜产量及品质。目前, 对于硒砂瓜的研究主要集中在产业的发展以及机械化生产等方面[10-11], 而对硒砂瓜连作土壤微生物多样性研究少有报道。近年来, 连作障碍是农业发展中研究的热点问题之一[12], 但对于宁夏中卫市环香山地区硒砂瓜的连作障碍鲜有研究。研究其连作条件下不同连作年限土壤真菌群落结构, 可为进一步研究连作土壤微生物多样性、减少有害真菌的积累、改善硒砂瓜品质等提供理论基础, 对研究硒砂瓜土传病害的生物防治及更好地发展硒砂瓜产业具有重要意义和实践价值。
1 材料与方法 1.1 研究地概况及试验设计试验地点位于宁夏中卫市沙坡头区兴仁镇(104°17′~106°10′E、36°06′~37°50′N), 海拔1 100~2 955 m, 属温带干旱气候, 年平均气温8.8 ℃, 年降水量179.6 mm, 年蒸发量1 829.6 mm, 农业生产对自然降水依赖性很强。研究地表层土为灰钙土, 地表有大量砂石覆盖, 硒含量为0.003 2 mg∙kg-1。
试验设置7个处理, 分别为连作5年(T5)、10年(T10)、15年(T15)、20年(T20)、25年(T25)、30年(T30)及对照土壤(未种植硒砂瓜土壤, T0), 各处理分别设置3个区, 根据连作时间进行区组设计, 每个区面积为0.33 hm2, 区之间距离较远。硒砂瓜品种为‘金城5号’种植时间为4月15—25日。施肥管理采用当地常规措施, 种瓜之前施1次羊粪作为基肥, 在苗期和坐果期追加磷酸二铵肥料。在种植前、苗期、坐果期、膨瓜期分别浇水1次。在果实采收结束后, 除去瓜苗, 以减少病害。其他田间管理措施均相同。
1.2 样本采集于2017年10月1日在宁夏中卫市沙坡头区兴仁镇硒砂瓜种植大田进行采样。在硒砂瓜采收后期去除表层(0~15 cm)砂石, 取深度为15~25 cm处取土, 每个处理各采集3份土壤, 每份土壤分别在每个区采用五点取样法取样, 除去土壤中的根系、碎石及其他杂物, 混匀成1份土壤装进塑封袋, 放入冰盒带回实验室:一部分鲜土放入超低温冰箱, 用于微生物多样性研究; 另一部分鲜土放入-4 ℃冰箱保存, 取出其中一部分土壤自然风干后过1 mm筛, 用于测定土壤中全氮、全钾、全磷、碱解氮、速效磷、速效钾、pH、有机质等含量。
1.3 土壤理化性质测定测定方法:土壤pH采用电位法(水:土=2.5:1), 土壤有机质含量采用重铬酸钾外加热法, 全氮采用凯氏定氮法, 碱解氮采用扩散法, 全磷采用矾钼黄比色法, 有效磷采用钼锑抗比色法, 全钾采用ICP法, 速效钾采用原子吸收分光光度计法。
1.4 土壤微生物群落结构多样性测定土壤样本送上海美吉生物医药科技有限公司的Illumina Miseq PE300平台(San Diego, CA, USA)进行测序。
1.5 序列分析原始测序序列使用Trimmomatic[13]软件质控, 使用FLASH软件进行拼接:去除质控后长度低于50 bp的序列; 去除模糊碱基; 根据重叠碱基overlap将两端序列进行拼接。使用的UPARSE v7.1软件[14], 对有效数据在97%相似度水平进行操作分类单元OTU聚类; 使用UCHIME软件[15]剔除嵌合体。利用RDP classifier(http://rdp.cme.msu.edu/)[16]对每条序列进行物种分类注释, 比对Unite (Release 6.0 http://unite.ut.ee/index.php)数据库, 设置比对阈值为70%, 并在各个分类水平上统计样本的群落组成。
1.6 数据处理试验数据采用Microsoft Excel 2016计算, 采用SPSS 19.0进行单因素方差分析(P < 0.05), 表中数据均采用平均值±标准差表示。
2 结果与分析 2.1 硒砂瓜连作对土壤理化性质的影响不同连作年限土壤pH均大于8, 为碱性土, 且土壤pH随连作年限的增加呈现先增加后减少趋势, 以T15土壤pH最大; 与T0相比, T5-T25处理土壤有机质、全氮、全磷含量均增加, 在T5中全氮、速效磷、全磷、速效钾、碱解氮含量最高, T15中有机质含量最高。从结果可知, 土壤综合理化性质与硒砂瓜连作年限不存在相关性。因此, 硒砂瓜连作障碍不是由于土壤理化性质的改变所导致的(表 1)。
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表 1 硒砂瓜连作对土壤理化性质的影响 Table 1 Effects of selenium-melon continuous cropping on soil physical and chemical properties |
高通量测序结果表明, 从7个样本(3次重复)21份土壤中共获得1 500 251条高质量的真菌基因序列, 平均阅读长度为264.50 bp, 样品中真菌有95%以上的序列长度都分布在221~360 bp, 将这些序列数以97%的序列相似性聚为4 005个不同的OTU。
2.3 硒砂瓜连作土壤真菌群落多样性分析 2.3.1 硒砂瓜土壤样本质量检测基于Sobs指数的稀释曲线分析表明, 随着样本测序量的增加, 各样本的稀释曲线基本趋向平坦, 获得的序列足以完全捕获真菌的多样性, 说明测序数据合理, 达到测序要求, 更多的数据量只会产生少量新的物种, 能够比较真实地反映土壤样本的真菌群落(图 1)。
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图 1 硒砂瓜连作土壤样本在OUT水平Sobs指数稀释曲线 Fig. 1 Rarefaction curves of OUT level Sobs index in soil samples of selenium-melon continuous cropping T0、T5、T10、T15、T20、T25、T30分别指未种植硒砂瓜处理及连作5年、10年、15年、20年、25年和30年处理。T0, T5, T10, T15, T20, T25, and T30 refer to the treatments of non-planting and continuous cropping for 5, 10, 15, 20, 25 and 30 years of selenium melon, respectively. |
Alpha多样性可以反映微生物群落的丰富度和多样性。不同连作年限土壤真菌群落的多样性指数如表 2所。结果表明, 真菌群落多样性为T15 > T10 > T20 > T0 > T30 > T5 > T25;物种丰富度为T15 > T10 > T20 > T0 > T5 > T30 > T25。Alpha多样性水平不同, 说明硒砂瓜长期连作会改变土壤真菌群落的组成和分布, T10、T15、T20中的物种多样性指数和丰富度指数均高于T0, 而T25、T30物种多样性指数和丰富度指数低于T0。连作时间对土壤真菌多样性指数和丰富度指数有一定的影响。
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表 2 硒砂瓜连作土壤真菌Alpha多样性指数 Table 2 Alpha diversity indexes of soil fungal under selenium-melon continuous cropping |
高通量测序结果表明, 所有土壤样本中共有真菌8个门, 25个纲, 244个属, 340个种。样本整体真菌种类相似, 然而在不同分类水平上物种丰富度所占比例不同。在门水平, 物种丰度最高的是子囊菌门(Ascomycota), 其次是接合菌门(Zygomycota)、担子菌门(Basidiomycota)和未分类真菌(unclassified_fungi), 丰度分别为56.38%~88.90%、8.21%~37.10%、4.50%~10.53%、1.49%~4.65%。T0中子囊菌门丰度最高, 随着连作时间的增加, 子囊菌门丰度降低; 接合菌门随连作时间增加, 丰度逐渐增加; 担子菌门在T20中丰度最高(图 2)。
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图 2 硒砂瓜不同连作年限土壤真菌群落在门水平的相对丰度 Fig. 2 Relative abundances of soil fungal communities at phylum level in different continuous cropping years of selenium-melon T0、T5、T10、T15、T20、T25、T30分别指未种植硒砂瓜处理及连作5年、10年、15年、20年、25年和30年处理。T0, T5, T10, T15, T20, T25, and T30 refer to the treatments of non-planting and continuous cropping for 5, 10, 15, 20, 25 and 30 years of selenium melon, respectively. |
对不同连作年限土壤真菌群落组成在纲水平进行分析, 丰度前5的物种分别为粪壳菌纲(Sordariomycetes)、norank_p_Zygomycota、散囊菌纲(Eurotiomycetes)、unclassified_p_Ascomycota、座囊菌纲(Dothidemycetes), 其中座囊菌纲在连作T15土壤中丰度最高(9.51%), 散囊菌纲在T20中丰度最高(35.39%), norank_p_Zygomycota在T25中丰度最高(37.10%), 其次是T30(34.29%)。随着连作年限增加，土壤中真菌类群呈逐渐上升的趋势, 其中粪壳菌纲数量逐渐减少, 新出现节担菌纲(Wallemiomycetes)、盘菌纲(Pezizomycetes), 酵母纲(Saccharomycetes)则消失(图 3)。
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图 3 硒砂瓜不同连作年限土壤真菌群落在纲水平相对丰度 Fig. 3 Relative abundances of soil fungal communities at class level in different continuous cropping years of selenium-melon T0、T5、T10、T15、T20、T25、T30分别指未种植硒砂瓜处理及连作5年、10年、15年、20年、25年和30年处理。T0, T5, T10, T15, T20, T25, and T30 refer to the treatments of non-planting and continuous cropping for 5, 10, 15, 20, 25 and 30 years of selenium melon, respectively. |
进一步对丰度前30的物种在属水平的Heatmap图分析显示, 丰度前5的属分别为被孢霉属(Mortierella)、绿僵菌属(Metarhiziun)、假霉样真菌属(Pseudallescheria)、镰刀菌属(Fusarium)、青霉属(Penicillium)。被孢霉属随着连作年限的增加, 丰度逐渐增加; 绿僵菌属在T0中丰度最高, 随连作年限增加呈先增加后下降的趋势; 假霉样真菌属在T5中丰度最高; 镰刀菌属随连作年限增加呈先增加后下降的趋势, 在T10中丰度最高; 青霉属丰度随连作年限增加出现先增加后下降的趋势, 在T20中丰度最高(图 4)。
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图 4 硒砂瓜不同连作年限土壤真菌群落在属水平Heatmap图 Fig. 4 Heatmap of soil fungal community at genus level in different continuous cropping years of selenium-melon T0、T5、T10、T15、T20、T25、T30分别指未种植硒砂瓜处理及连作5年、10年、15年、20年、25年和30年处理。T0, T5, T10, T15, T20, T25, and T30 refer to the treatments of non-planting and continuous cropping for 5, 10, 15, 20, 25 and 30 years of selenium melon, respectively. |
基于Bray-Curtis距离算法对不同连作年限的硒砂瓜土壤真菌群落进行NMDS分析。结果显示, 在T0、T5、T10、T15、T20、T25、T30土壤中部分样品的硒砂瓜土壤真菌群落间距离较近, 组成比较相似, 说明随着连作年限的增加, 硒砂瓜土壤真菌群落组成趋于一致(图 5)。
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图 5 硒砂瓜不同连作年限土壤真菌基于OTU水平的NMDS分析 Fig. 5 NMDS analysis of soil fungi based on OTU level in different continuous cropping years of selenium-melon T0、T5、T10、T15、T20、T25、T30分别指未种植硒砂瓜处理及连作5年、10年、15年、20年、25年和30年处理。T0, T5, T10, T15, T20, T25, and T30 refer to the treatments of non-planting and continuous cropping for 5, 10, 15, 20, 25 and 30 years of selenium melon, respectively. |
相关性分析表明, 全磷、碱解氮、速效磷含量是影响土壤真菌群落最主要的因子。被孢霉属丰富度与各土壤理化因子间没有显著的相关性, 绿僵菌属丰富度与全钾含量有显著正相关性(P < 0.05), 假霉样真菌属丰富度与全磷、速效钾间存在显著(P < 0.05)和极显著(P < 0.01)的正相关性, 镰刀菌属丰富度与全磷、碱解氮间存在极显著的负相关性(P < 0.01), 青霉属丰富度与pH间存在显著正相关性(P < 0.05), 毛壳属丰富度与速效钾间存在显著正相关性(P < 0.05)(表 3)。
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表 3 土壤真菌优势菌(属水平)丰度与土壤理化性质的相关性 Table 3 Correlation between abundance of soil fungal dominant bacteria (genus level) and soil physicochemical properties |
硒砂瓜是宁夏地区特有的经济作物。有研究表明, 由于长期的连作, 导致土壤肥力下降, 微生物群落多样性降低, 存在潜在的土壤肥力衰退趋势[17]。而在本研究中, 长期连作并未显著改变土壤理化性质。土壤微生物群落多样性能够反映土壤健康状况, 同时微生物群落结构和物种组成多样性的增加能够增加土壤微生态的稳定性。真菌在土壤环境中广泛存在, 对连作土壤中土传病害的发生及作物正常发育有很大影响。本研究中, 长期连作土壤与对照相比, 真菌群落多样性和丰富度指数呈先上升后下降趋势。这一结果与采用磷脂酸生物标记的方法研究不同连作年限怀牛膝(Achyranthes bidentata Blume.)土壤微生物多样性结果相似[18]。这可能是由于长期高强度的农业耕作措施破坏了土壤稳定结构, 减小微生物丰度和均匀度, 不利于土壤微生物的代谢, 导致微生物多样性降低。由于硒砂瓜是压砂种植, 对土壤性质或土壤养分的影响较大, 进而使得土壤真菌群落分布不均。
3.2 硒砂瓜连作对真菌群落结构的影响硒砂瓜土壤中, 在门水平上相对丰度依次为子囊菌门、接合菌门、担子菌门, 与阎海涛等[19]和赵帆等[20]研究结果一致。随着连作年限的增加, 微生物类群的改变和成分的变化会扰乱土壤微生态的平衡, 更严重的会导致植物的死亡[21]。大量研究表明, 微生物多样性会受到连作时间的影响[22]。在本研究中, 随着连作时间的增加子囊菌门丰度逐渐下降。Schoch等[23]研究表明, 子囊菌门在根际土壤有机物的降解中起着重要作用。据此推测子囊菌门可能与土壤有机质降解及土壤肥力下降有关。接合菌门丰度随连作时间的增加而增加, 是引发植物病害和破坏生物多样性的来源之一[24]。因此, 病害的发生可能与子囊菌门及接合菌门丰度的变化有关。
植物的生长与土壤中各种微生物的生理活动密切相关[25]。而真菌在土壤环境中起着重要作用, 同时也是引起农作物病害主要病原菌的来源[26], 其中镰刀菌属是土传病害中主要的病原菌属。本研究中, 被孢霉属丰度随连作时间的增加变化显著, 而被孢霉属是土壤中有益微生物, 具有溶解土壤中磷的功能[27], 并且能够通过提供氮营养和提高植物的抗病性来促进植物的生长, 可能与植物的糖代谢有关[28]。镰刀菌属是硒砂瓜连作土壤中主要的有害属[29], 是引起枯萎病的主要病害。此外, 研究发现青霉属微生物在不同连作年限的土壤中均有分布, 其中在T20中含量最高, 而青霉属真菌是自然界中生物有机成分的重要分解者, 能产生多种有活性的次生代谢产物, 以抵抗真菌、细菌等[30]。土壤微生物群落的组成主要是由土壤本身的性质以及耕作方式、作物类型和管理模式等因素决定[21]。近年来, 不少研究认为多年在同一块地种植相同作物, 会造成有益微生物数量减少及病原菌数量增加, 长此以往会影响植物的健康生长、正常发育等生命活动。如华菊玲等[31]研究表明连作会导致芽孢杆菌属(Bacillus)微生物数量减少, 而尖孢镰刀菌和青枯劳尔氏菌(Ralstonia)数量显著高于未连作土壤。除土壤环境中微生物数量变化, 土壤理化性质的改变也会影响土壤微生物区系的变化。焦润安等[32]研究发现连作可引起土壤理化性质恶化, 土壤养分失衡, 酚酸类物质积累, 最终导致微生物群落改变, 降低土壤的健康状况, 影响马铃薯(Solanum tuberosum L.)生长。在长期连作过程中, 病原菌以菌丝和分生孢子在植物残骸或土壤中越冬, 在土壤中长久生存。本研究中, T5土壤中镰刀菌属丰度最低, 假霉样真菌属丰度最高; 在T10中镰刀菌属丰度最高, 而假霉样真菌属几乎消失。由此可推测假霉样真菌属与镰刀菌属病原菌有一定相互作用, 其次与细菌群落中一些有益菌属丰度增加有关, 还需进一步验证。
3.3 土壤理化性质对真菌群落结构的影响在连作条件下, 土壤理化性质能够更好地体现土壤的健康状况, 并且能够影响土壤微生物种群数量及分布, 不同植被的营养代谢活动导致土壤中养分具有一定的差异[3]。在本研究中, 随着连作时间延长, 土壤理化性质与连作年限间并没有显著的相关性, 但土壤理化性质与各真菌群落间有一定的相关性。Song等[6]研究黄连(Coptis chinensis Franch.)连作结果表明, 环境理化性质可直接或者间接影响真菌的生长, 从而影响真菌群落。有研究表明, 土壤理化因子与土壤微生物群落显著相关, 土壤环境因子的改变, 会影响土壤中微生物群落结构[33-34]。本研究中, 全磷、碱解氮、有效磷是影响连作硒砂瓜土壤真菌群落的主要因子, 各理化因子会显著影响相关真菌微生物群落, 其中全磷、碱解氮与镰刀菌属呈现显著的负相关, 说明全磷和碱解氮含量的增加会导致镰刀菌属丰度的减少, 因此, 推测在进行病原菌防治过程中, 可增加土壤中磷和氮含量抑制镰刀菌属病原菌的生长, 目前还没有通过改变土壤理化性质来防治病原菌的研究, 还需要进一步证明。
4 结论随着连作时间的增加, 土壤中真菌多样性指数与丰富度指数先增加后减小, 连作改变了真菌群落在门和属水平的群落组成, 全磷、碱解氮、有效磷含量是影响土壤真菌群落最主要的因子。土壤理化性质与硒砂瓜连作年限没有显著的相关性, 与土壤中真菌群落结构存在显著的相关性, 土壤养分的变化会显著影响真菌微生物群落结构。通过研究硒砂瓜连作对土壤真菌群落结构的影响, 为了解硒砂瓜连作条件下微生群落多样性奠定基础, 也为后续研究连作障碍的生物防治提供研究基础和理论依据。
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