2019, Vol. 27
2. 山西省临汾市农机局 临汾 041000
, LYU Beibei1, ZHANG Liping1, LIU Zhen1, FAN Qiaolan1, WEI Mingfeng1, YAO Zhong1, YUAN Jiawei1, CHAI Yuejin2
2. Agricultural Machinery Bureau of Linfen City, Linfen 041000, China
保护性耕作是以秸秆覆盖还田、农田免耕或少耕、施肥、播种等复式作业为主要内容的一种新型旱作机械化耕作方式[1-2]。与传统耕作方式相比, 保护性耕作不仅省工、省力、减少投入, 而且可减少水土流失, 保持土层结构, 改善土壤理化性质, 促进微生物的繁殖[3-5]。研究表明, 不同类型生境中, 微生物的群落组成存在明显差异[6], 耕作方式不同, 土壤环境也会不同, 进而引起土壤微生物的数量和结构组成发生改变[7]。Yan等[8]对耕作和免耕变性土微生物群落功能多样性的研究显示, 免耕比传统耕作更有利于增加土壤微生物多样性。李彤等[9]研究发现西北地区旱作麦田采用保护性耕作, 可以影响土壤微生物群落丰度, 并显著影响土壤理化性质, 进而影响土壤微生物空间结构。
20世纪60年代保护性耕作传入我国[10], 由于其能够增加土壤蓄水, 增强土壤抗旱能力, 提高作物产量, 降低生产成本等, 在我国北方旱地得到了广泛应用[11]。为提高我国北方干旱地区农业生产水平, 1992年中国农业大学和山西省农机局受澳大利亚国际农业研究中心资助, 在山西省临汾市开展了旱地保护性耕作体系研究。张贵云等[12]以该试验基地为平台, 开展了长期保护性耕作对丛枝菌根真菌多样性的影响研究, 结果表明, 保护性耕作提高了丛枝菌根真菌(AMF)多样性, 且深松与免耕相结合的保护性耕作方式, 更有利于提高土壤AMF多样性。土壤细菌是土壤生态系统中不可或缺的部分, 参与多种土壤生理生化过程, 如土壤有机质的分解、腐殖质的形成、养分的转化和循环等, 土壤生态系统的质量和健康与土壤中细菌群落结构的变化有很大关系[13-14], 因而对土壤微生物的研究尤其是原核微生物群落结构的研究尤为重要。近年来, 人们运用高通量手段研究土壤微生物的技术日趋成熟, 这为深入分析微生物资源提供了可能[15]。
高通量测序技术是对传统测序技术的一次革命性创新[16], 其产生的16S rRNA基因的测序数据, 覆盖深度高, 可以用来估计微生物群落的物种组成, 能更真实地揭示环境中微生物群落的复杂度和多样性[17]。目前为止, 国内外有关保护性耕作田土壤微生物多样性的研究有了一定的报道, 但是黄土高原旱作麦田长期保护性耕作对土壤原核微生物群落的影响, 尚鲜见研究报道。本研究以山西临汾旱地实施保护性耕作26年的小麦田为试验平台, 采用Illumina Hiseq 2500高通量测序平台测序土壤16S rDNA, 结合土壤质量环境因子的典型相关分析(CCA), 对不同保护性耕作措施对土壤原核微生物群落和土壤环境的影响进行研究, 探寻保护性耕作技术应用的新理论和新策略, 为在微生物水平上研究黄土高原旱作地区保护性耕作技术提供重要理论支撑。
1 材料与方法 1.1 研究区域概况试验基地位于山西省临汾市尧都区城隍村(36°01’53″N, 111°37’46″E, 海拔555 m)。试验区域年平均气温12.2 ℃, 年0 ℃以上积温4 600 ℃, 无霜期195 d, 年平均地温13.8 ℃。年均降水量515.7 mm, 且均集中在7-9月份; 年均蒸发量1 933.1 mm。土壤类型为碳酸盐褐土, 试验地种植制度为长期单一种植冬小麦(Triticum aestivum)。
1.2 耕作处理方式2017年5月, 借助1992年在山西省临汾市开始的保护性耕作体系长期定位试验[18], 开展了黄土高原旱作麦田长期保护性耕作对土壤原核微生物群落多样性及土壤肥力的影响研究。本试验选择26年的免耕覆盖(NTS)、连续深松覆盖4年后免耕22年的免耕覆盖(SNTS)以及26年的传统耕作(TT1)3种耕作处理方式。其中, NTS为全年不耕作, 播种时用免耕播种机一次性完成施肥和播种, 收获后将各小区秸秆粉碎全覆盖; SNTS是深松(深度约40 cm)后, 进行长期的免耕覆盖处理; TT1是小麦收获后用铧式犁耕翻(深度约25 cm), 无秸秆覆盖, 播前旋耕(深度约15 cm)整地。各处理重复3次, 每小区面积为600 m2。试验地无灌溉条件, 作物靠自然降水生长。播种时间: 2016年9月25日, 小麦品种为‘长6359’, 播种量为120 kg·hm-2。试验田化肥使用量:尿素为225 kg·hm-2, 磷酸二铵为150 kg·hm-2。
1.3 土壤样品采集于2017年5月8日(小麦灌浆期)采取小麦根际土样, 每小区随机选3点, 每个样点先去掉表土, 再从0~20 cm土层取小麦根际土样, 每点采集3份土样均匀混合成一个样品。将所采集的土样分为两部分, 一部分保存于灭菌的塑封袋中, 于低温条件下带回实验室, 保存于-80 ℃冰箱中用于提取DNA, 供土壤原核微生物群落结构多样性分析; 另一部分保存于普通塑封袋中, 带回实验室自然风干, 根据试验需要分别过18目、100目筛子用于土壤理化性质的测定。土壤水分和容重指标则分别取自同一样点0~10 cm、10~20 cm土层。
1.4 测定方法土壤理化性质测定: pH采用1:2.5土水比浸提酸度计法, 土壤水分采用烘干法, 土壤容重采用环割法, 有机质采用重铬酸钾容量法-稀释热法, 全氮采用半微量开氏法, 碱解氮采用碱解扩散法, 速效磷采用0.5 mol×L-1 NaHCO3法, 速效钾采用NH4OAc浸提-火焰光度法测定[19]。
土壤总DNA的提取及16S rRNA基因的PCR扩增:土壤总DNA基因组的提取采用DNA提取试剂盒进行。采用引物515F(5’-GTGCCAGCMGCCGC GGTAA-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCT AAT-3’)扩增土壤微生物16S rRNA基因Ⅴ4区。30 μL PCR反应体系: Phusion Master Mix (New England Biolabs, 2×)15 μL, Primer (2 μmol×L-1) 3 μL, Genomic DNA (1 ng×μL-1) 10 μL, dd H2O 2 μL。PCR反应条件: 98 ℃预变性1 min; 98 ℃ 10 s, 50 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 30个循环; 72 ℃, 5 min。每个样本3次重复, 根据PCR产物浓度进行等浓度混样, 充分混匀后使用1×TAE浓度2%的琼脂糖胶电泳纯化PCR产物, 选择主带大小在400~450 bp之间的序列, 割胶回收目标条带。产物纯化试剂盒使用的是Thermo Scientific公司GeneJET胶回收试剂盒。
原核微生物16S rRNA基因Ⅴ4区高通量测序:经纯化检测之后的土样送至北京诺禾致源科技股份有限公司, 进行基因组DNA的提取和PCR扩增、PCR产物的混样和纯化, 使用New England Biolabs公司的NEB Next®UltraTMDNA Library Prep Kit for Illumina建库试剂盒进行文库的构建, 构建好的文库经过Qubit定量和文库检测合格后, 使用Illumina公司的HiSeq 2500测序平台, 进行上机测序。
运用Uparse软件对序列进行聚类, 以97%的一致性(Identity)将序列聚类成为OTUs。采用软件RDP classifier进行物种分类。分别在门(phylum)和属(genus)水平上统计各样本的群落组成, 并对OTU进行生态学分析, 使用Qiime软件计算土壤物种相对丰度、Chao1、ACE、Shannon、Simpson指数等, 使用R软件绘制稀释曲线。对OTUs进行多序列比对, 用Qiime软件构建系统发生树, 获得不同样品和分组的群落结构差异, 通过UPGMA样品聚类树进行展示。选用LEfSe统计分析方法对分组样品的物种组成和群落结果进行差异显著性检验。同时, 进行CCA分析和多样性指数与环境因子间的相关性分析, 得到显著影响组间群落变化的环境因子。
采用SPSS 20.0对土壤理化数据进行统计分析, 使用R语言分析微生物多样性数据, 运用Canoco软件进行环境因子对微生物群落结构的影响分析。
2 结果与分析 2.1 保护性耕作措施对土壤理化性质的影响由表 1可以看出, 在0~20 cm土层土壤中, NTS和SNTS 2个处理的土壤全氮、碱解氮、速效磷及速效钾含量均显著高于TT1处理, 而其pH显著低于TT1, SNTS处理的土壤有机质含量显著高于NTS和TT1处理。TT1处理的土壤含水量和容重与其他处理间差异均显著, NTS和SNTS处理间差异不显著, 3个处理土壤含水量依次为NTS > SNTS > TT1; 0~10 cm土层土壤容重依次为TT1 > NTS > SNTS, 10~20 cm土层土壤容重为NTS > SNTS > TT1。结果显示, 保护性耕作与传统耕作相比, 显著提高了土壤中的全氮、碱解氮、速效磷及速效钾的含量, 显著降低了土壤pH, 且深松免耕处理显著增加了土壤有机质的含量; 同时, 保护性耕作还可以增加土壤贮水能力, 提高土壤水分含量, 降低0~10 cm土层的土壤容重, 但提高10~20 cm土层的土壤容重。
|
表 1 长期不同耕作方式下土壤的理化性质 Table 1 Soil physical-chemical characteristics under different long-term tillage treatments |
为检测样本的数据量是否合理, 从样品中随机抽取一定测序量的数据, 统计它们所代表物种数目(即OTUs数目), 以抽取的测序数据量与对应的物种数来构建稀释曲线, 不同耕作方式土壤样品原核微生物稀释曲线见图 1。由图 1可知, 随着测序量的增加, 原核微生物稀释曲线逐渐趋于平坦, 但尚未达到饱和, 更多的测序量只会产生少量新的OTU, 表明本次试验的测序数据量合理, 能够较真实地反映这3组土壤样品的原核微生物群落, 说明测序结果包含了大多数原核微生物类群, 基本可以反映不同耕作下土壤生境中原核微生物群落结构与组成, 但仍有少量的原核微生物种类未被发现。
|
图 1 长期不同耕作方式下土壤原核微生物稀释曲线 Fig. 1 Soil bacterial rarefaction curves under different long term tillage treatments NTS:免耕覆盖; SNTS:深松免耕覆盖; TT1:传统耕作。 NTS: no-tillage with stubble; SNTS: no-tillage with stubble after subsoiling; TT1: traditional tillage. |
不同处理土壤原核微生物种类OTU数量关系韦恩图如图 2所示, 3个处理共产生9 235个OTU, 共同包含的OTU个数为4 466, 占总OTU数量的48.36%。其中, NTS共得到7 257个OTU, SNTS共得到6 547个OTU, TT1共得到6 384个OTU。NTS中特有的OTU为1 314个, 占总OTU数量的14.23%; SNTS中特有的OTU为732个, 占总OTU数量的7.93%; TT1中特有的OTU为702个, 占总OTU数量的7.60%。表明3个处理原核微生物的群落结构差异较大。分别将3组两两比较发现, TT1和NTS共有的OTU为5 138个, TT1和SNTS共有的OTU最少, 为5 010个, NTS和SNTS共有的OTU最多, 为5 271个。
|
图 2 长期不同耕作方式下土壤原核微生物Venn图 Fig. 2 OTUs Venn of soil bacteria in the soil samples under different long term tillage treatments NTS:免耕覆盖; SNTS:深松免耕覆盖; TT1:传统耕作。 NTS: no-tillage with stubble; SNTS: no-tillage with stubble after subsoiling; TT1: traditional tillage. |
门分类水平上, 不同耕作方式下原核微生物群落组成及相对丰度见图 3。从图 3可知, 3个处理土壤原核微生物群落在门水平上的组成基本相同, 但平均相对丰度所占比例略有差异。各处理中原核微生物类群相对丰度排名前10的有变形菌门(Proteobacteria, 占31.45%)、酸杆菌门(Acidobacteria, 占16.51%)、放线菌门(Actinobacteria, 占14.94%)、厚壁菌门(Firmicutes, 占3.69%)、拟杆菌门(Bacteroidetes, 占8.74%)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes, 占6.51%)、浮霉菌门(Planctomycetes, 占3.09%)、奇古菌门(Thaumarchaeota, 占2.87%)、疣微菌门(Verrucomicrobia, 占3.08%)、绿弯菌门(Chloroflexi, 占2.65%), 它们占总类群的92.43%~93.84%。其中, 变形菌门、酸杆菌门和放线菌门为明显优势菌群, 分别占3个处理平均相对丰度10%以上, NTS处理3次重复平均相对丰度分别为34.24%、13.23%、14.06%, SNTS处理分别为28.02%、18.48%、17.02%, TT1处理分别为32.07%、17.83%、13.73%。统计分析结果显示, 3个处理中优势菌门平均相对丰度均未达到显著性差异水平(P > 0.05)。其他7个菌门的平均相对丰度较低, 所占比例均小于10.0%。统计分析结果显示, 除疣微菌门在NTS和SNTS处理中平均相对丰度达到显著差异水平(P < 0.05), 绿弯菌门在NTS和SNTS、NTS和TT1处理中平均相对丰度达到显著差异水平(P < 0.05)外, 厚壁菌门、拟杆菌门、芽单胞菌门、浮霉菌门、奇古菌门在3个处理中均未有明显差异。此外, 还有6.47%的原核微生物类群未被分类。结果表明, 与传统耕作相比, 免耕显著降低了绿弯菌门的相对丰度; 与深松免耕相比, 免耕显著降低了土壤中疣微菌门和绿弯菌门的相对丰度, 其他原核微生物门的相对丰度在3个处理间尚未有明显差异。
|
图 3 长期不同耕作方式下土壤原核微生物群落在门水平上的组成及相对丰度 Fig. 3 Soil bacterial community composition and relative abundance at phylum level under different long term tillage treatments NTS:免耕覆盖; SNTS:深松免耕覆盖; TT1:传统耕作。 NTS: no-tillage with stubble; SNTS: no-tillage with stubble after subsoiling; TT1: traditional tillage. |
属水平上, 不同耕作方式下原核微生物群落的组成及相对丰度如图 4所示。在属水平上, 3个处理中原核微生物类群的平均相对丰度均小于5.0%, 其中RB41属是3个处理共同的优势菌群(占3.26%), 在TT1处理中的相对丰度最高, 未被分类的原核微生物类群占到86.02%。在3种处理的土壤样品中, 未分类的原核微生物成了第一大类群, 说明随着分类的细化, 相关数据库中可用信息量越来越少, 同时也说明土壤中含有一定数量的潜在原核微生物类群。
|
图 4 长期不同耕作方式下土壤原核微生物群落在属水平上的组成及相对丰度 Fig. 4 Soil bacterial community composition and relative abundance at genus level under different long term tillage treatments TT1:传统耕作; NTS:免耕覆盖; SNTS:深松免耕覆盖。 TT1: traditional tillage; NTS: no-tillage with stubble; SNTS: no-tillage with stubble after subsoiling; TT1: traditional tillage. |
使用Qiime软件计算Unifrac距离, 并基于Weighted Unifrac方法构建UPGMA样品聚类树, 对3个处理的土壤原核微生物群落构成的相似性进行聚类分析, 并将聚类结果与各样品在门水平上的物种相对丰度进行整合展示(图 5)。结果表明, 3个处理可分为2大类, 其中NTS和SNTS处理的土壤原核微生物群落组成趋于一类, 在聚类关系上趋同性较强, TT1处理单独为一类。表明免耕土壤原核微生物种群结构与深松免耕覆盖并没有明显差异, 亲缘关系较近, 说明深松4年之后免耕覆盖22年土壤原核微生物种群结构变化趋于免耕。
|
图 5 长期不同耕作方式下土壤原核微生物群落相似性聚类树 Fig. 5 Similarity tree of soil bacterial communities under different long term tillage treatments NTS:免耕覆盖; SNTS:深松免耕覆盖; TT1:传统耕作。 NTS: no-tillage with stubble; SNTS: no-tillage with stubble after subsoiling; TT1: traditional tillage. |
Chao1指数和ACE指数表征物种的丰富度, 其值越高表明原核微生物群落的物种丰富度越高; Shannon指数和Simpson指数表征微生物多样性程度, Shannon指数越高表明原核微生物群落的多样性越高, Simpson指数与之相反; Coverage是指各样本文库的覆盖率[20-22]。
表 2是不同耕作方式下土壤原核微生物的多样性指数。从表 2可以看出, 3个处理文库覆盖率均在98%以上, 能够较为全面地反映不同耕作措施下土壤原核微生物群落的种类和结构。综合丰富度指数Chao1和ACE以及多样性指数Shannon和Simpson指数, 3个处理土壤环境原核微生物群落多样性由高到低排序为: NTS > SNTS > TT1。统计分析结果, 3个处理的Chao1指数和ACE指数差异不显著。不同耕作处理对原核微生物群落的多样性影响程度均不同, 与传统耕作相比, 免耕显著增加了土壤原核微生物群落的多样性, 未显著改变原核微生物群落的丰富度; 深松免耕处理对原核微生物群落的多样性和丰富度均未有显著改变。
|
|
表 2 长期不同耕作方式下土壤原核微生物群落的多样性指数 Table 2 Diversity and richness of soil bacteria communities under different long term tillage treatments |
通过LEfSe分析, 可以找出组间具有显著差异的Biomarker, 以及显著影响组间差异性的物种或群落[23]。不同耕作方式下土壤原核微生物群落组间差异LEfSe分析柱状图和进化分支图如图 6所示, 不同处理对应不同的Biomarker, NTS处理的显著性差异物种(Biomarker)最多, SNTS次之, TT1最少。在门水平上, TT1样品中有1个主要门(疣微菌门)的细菌存在显著差异, SNTS样品中有1个主要门(奇古菌门)的古菌存在显著差异, TT1样品在门水平上无显著差异。在属水平上, SNTS中放线菌门的Pseudarthrobacter、变形菌门的Steroidobscte共2属的细菌存在显著差异, NTS中变形菌门的Sphingomonas、衣原体门的Estrella、拟杆菌门的Pontibacter共3属的细菌存在显著差异。
|
图 6 长期不同耕作方式下土壤原核微生物群落处理间差异LEfSe分析图(A)和进化分支图(B) Fig. 6 Histogram (A) and cladogram (B) based on LEfSe analysis of soil bacterial communities under different long term tillage treatments NTS:免耕覆盖; SNTS:深松免耕覆盖; TT1:传统耕作。 NTS: no-tillage with stubble; SNTS: no-tillage with stubble after subsoiling; TT1: traditional tillage. |
土壤理化性质的变化会直接或间接的影响土壤微生物群落结构的组成[24-25]。为分析不同耕作方式土壤生境中原核微生物群落与土壤环境因子特性间的关系, 以原核微生物群落在门水平上的相对丰度数据为物种数据, 土壤理化数据为土壤环境变量, 采用Canoco软件进行了CCA, 其结果排序如图 7所示, 第1排序轴对土壤原核微生物群落变化解释最多, 达62.35%;第2排序轴仅解释了原核微生物群落变化的23.75%, 前两轴共解释了原核微生物群落总变异的86.10%, 在对原核微生物群落变异的解释中起主导作用。其中, pH(r=0.968 5)、速效氮(r=-0.836 8)、速效磷(r=-0.898 4)、速效钾(r=-0.994 1)与第1排序轴相关性较高, 全氮(r=-0.719 6)、有机质(r=-0.917 7)与第2排序轴相关性较高。结果表明, 土壤pH、有机质、速效氮、速效磷、速效钾含量对土壤原核微生物群落遗传多样性的变化起着重要作用。3个处理样本中, TT1.1、TT1.2、NTS.3相距较近, 说明这3个样本的群落结构相近, NTS.1、NTS.2、SNTS.2、TT1.3相距较近, 说明这4个样本的群落结构相近; NTS.1及NTS.2与NTS.3相距较远, TT1.1及TT1.2与TT1.3相距较远, SNTS.1、SNTS.2、SNTS.3相距较远, 说明取样过程中空间分布的不均匀及复杂性也会影响原核微生物的群落结构。同时, TT1的3个样本与NTS.3、SNTS.1相距较远, 说明这3组样本之间群落结构存在差异。结果表明, 与传统耕作相比, 保护性耕作在一定程度上能够改变土壤原核微生物群落结构, 但仍存在结构的相似性。
|
图 7 门水平下长期不同耕作处理的土壤原核微生物群落与土壤理化因子的典型对应分析 Fig. 7 Canonical correspondence analysis (CCA) ordination biplot between bacterial community structure and soil environmental factors at phylum level under different long term tillage treatments TN、AN、AP、AK、OM分别代表土壤全氮、碱解氮、速效磷、速效钾、有机质含量。NTS:免耕覆盖; SNTS:深松免耕覆盖; TT1:传统耕作。 TN, AN, AP, AK and OM represented total N, available N, available P, available K and organic matter, respectively. NTS: no-tillage with stubble; SNTS: no-tillage with stubble after subsoiling; TT1: traditional tillage. |
不同耕作方式对土壤养分的影响有所不同[26]。Dolan等[27]和Filho等[28]研究发现, 长期免耕提高了土壤表层有机质的含量。本研究结果表明, 长达26年的免耕和深松免耕处理, 改变了0~20 cm土层的理化性质, 其中土壤的有机质、全氮、碱解氮、速效磷、速效钾含量相对于传统耕作均有不同程度的提高, 这一结论与杨培培等[29]、李友军等[30]研究结果一致, 说明保护性耕作能够提高土壤肥力, 促进作物生长。戴亮[31]在不同耕作方式对土壤微生物及土壤固碳能力影响的研究中指出, 深松免耕同时兼具翻耕和免耕的优点, 可以降低土壤有机质的矿化速率, 加深土壤腐殖质化程度, 减缓土壤有机碳的损失。许菁等[32]通过5年的定位试验, 开展了长期保护性耕作对小麦-玉米(Zea mays)两熟农田土壤碳储量及固碳潜力的影响研究, 结果表明, 秸秆翻入土壤后在很大程度腐解, 与无秸秆还田土壤有机碳储量之间的差距逐渐拉大, 土壤碳储量达到峰值, 说明不同耕作方式使秸秆在土壤中的腐解环境不同, 引起秸秆腐解速率的不同, 土壤中秸秆腐解程度随时间的推进而提高。本试验结果发现, 长期保护性耕作与传统耕作相比, 免耕处理和深松免耕处理的土壤有机质含量也均有不同程度的提高, 且深松免耕优于免耕, 前者显著提高了土壤有机质的含量, 较传统耕作提高了61.50%, 可能因为深松免耕促进了腐生菌增殖, 更有利于土壤有机质的提高。
保护性耕作可以增加土壤的贮水能力, 提高土壤水分含量, 这是因为保护性耕作在土壤表面覆盖有作物残茬, 与传统耕作相比其地表裸露面积减少, 从而土壤水分蒸发减少, 提高了土壤蓄水保墒能力[33]。本研究表明, 保护性耕作显著提高了黄土高原旱作小麦田土壤含水量, 有较明显的优势。土壤容重是衡量土壤肥力的重要指标之一[34]。相关研究表明, 传统翻耕的土壤容重大于保护性耕作[35], 本研究发现0~10 cm土层传统耕作处理土壤容重高于免耕和深松免耕, 这与上述观点相一致, 可能是由于保护性耕作措施增加了土壤的透气性和有机质含量, 在一定年限后有利于降低土壤容重[36]。而本研究3个处理10~20 cm和0~10 cm土层土壤容重变化规律不一致, 10~20 cm土层土壤容重变化表现为免耕处理高于传统耕作和深松免耕, 与上述观点不一致。赵洪利等[37]研究发现, 免耕与深松、翻耕处理相比, 土壤容重增大, 和本研究10~20 cm土壤容重结论一致, 可能是因为本试验进行的长期免耕处理无土壤耕作, 在长达26年的降水和自身重力影响下, 使得10~20 cm土层的土壤容重大于深松免耕和传统耕作处理。CCA结果表明, 土壤原核微生物群落结构多样性是多个土壤环境因子共同作用的结果, 其中pH、有机质、速效氮、速效磷、速效钾含量对于研究区土壤原核微生物群落遗传多样性的变化起着重要作用, 说明土壤碳、氮等营养元素对原核微生物的多样性有显著影响[24]。
土壤微生物类群中, 以细菌居多, 通常能占到70%~90%, 其种类繁多、功能多样, 具有最为丰富的遗传多样性[25, 38]。不同耕作方式对土壤原核微生物群落结构、种类、数量存在一定的影响, 采用高通量测序技术对土壤原核微生物16S rRNA基因的Ⅴ4高变区进行扩增测序分析, 结果表明, 3种处理在97%的相似度水平上, 共产生9 878种属分类水平的原核微生物(OTUs), 此外测序还发现了许多未被分类的原核微生物, 需通过深度测序或利用其他先进手段对微生物进行更细致地分类研究。在门分类水平上, 土壤主要优势菌群为变形菌门、酸杆菌门和放线菌门, 其中变形菌门的丰度最高。这与Roesch等[39]对土壤微生物的研究相一致, 可能是因为变形菌门是细菌中最大的一个门, 且该试验基地土壤呈弱碱性, 而变形菌门则是碱性土壤中的主要优势菌群[40]。有研究报道曾指出, 变形菌门中的许多类群可起到固氮作用, 并能适应各种复杂环境, 环境条件的变化对其分布和相对丰度影响不大[41], 本试验中变形菌门在3个处理间差异并不显著, 这一结论与上述观点相符合。
Doran[42]曾认为, 免耕由于对土壤的机械扰动较小, 土体基本处于一种相对厌氧的状态, 土壤微生物的数量及活性维持在相对稳定水平, 进而可能导致了土体芽孢细菌数量上升。Liu等[43]曾认为, 土壤扰动会降低土壤微生物的多样性和活性。Bending等[44]曾认为, 秸秆或根茬还田能提高土壤微生物的多样性。本研究结果表明不同耕作措施对土壤原核微生物的多样性影响均不同, 总体表现出保护性耕作高于传统耕作, 且免耕覆盖显著提高了土壤原核微生物群落的丰富度和多样性, 这一结论与上述观点相符合。可能是因为秸秆还田腐解过程中的部分产物, 如糖类、氨基酸、蛋白质、维生素及有机酸、酚类等, 为微生物的生长繁殖提供了丰富营养; 另一方面, 保护性耕作能改善土壤结构, 增加土壤透气性, 土壤微生物种类随之增加, 从而引起土壤原核微生物多样性的增加[45-46]。表明长期保护性耕作对提高土壤原核微生物群落丰富度和多样性更有利, 免耕可能会更有效地为当季作物提供养分[7]。
4 结论黄土高原旱作区长期免耕覆盖、连续深松覆盖免耕覆盖以及传统耕作下, 0~20 cm土层土壤中主要优势菌群为变形菌门、酸杆菌门和放线菌门, 均未出现独有种群。与传统耕作相比, 保护性耕作的原核微生物差异物种(Biomarker)明显多于传统耕作。不同耕作措施虽在一定程度上不会改变土壤原核微生物的组成和种类, 但会影响其相对分布。
黄土高原旱作区长期保护性耕作措施, 提高了土壤有机质含量、全氮、碱解氮、速效磷、速效钾含量, 降低了土壤pH, 改善了土壤性状。其中, pH、有机质、速效氮、速效磷、速效钾含量是影响土壤原核微生物群落遗传多样性重要理化因子。
本研究试验结果表明, 黄土高原旱作区连续多年的免耕处理是相对较优的耕作处理措施, 适宜该地区积极推广。
本研究中, 3个处理土壤样品的16S rDNA高通量测序获取了大量的序列, 在一定程度上为后续研究提供了一定的理论支撑, 但由于稀释曲线仍未完全饱和, 因此, 还有待进行更深一步的研究。另外, 有关保护性耕作对土壤微生物的影响还需结合多学科、多方法进行综合评价, 以便获得更有效和全面的研究结论。在后续研究中, 我们将增设不同年份的取样试材, 以便能够更完整地反映出不同耕作方式对土壤环境的动态影响。
| [1] |
向新华, 魏巍, 张兴义, 等. 保护性耕作对大豆生长发育及土壤微生物多样性影响[J]. 大豆科学, 2013, 32(3): 321-327. XIANG X H, WEI W, ZHANG X Y, et al. Effect of conservation tillage systems on soybean growth and soil microbial diversity[J]. Soybean Science, 2013, 32(3): 321-327. |
| [2] |
高旺盛. 论保护性耕作技术的基本原理与发展趋势[J]. 中国农业科学, 2007, 40(12): 2702-2708. GAO W S. Development trends and basic principles of conservation tillage[J]. Scientia Agricultura Sinica, 2007, 40(12): 2702-2708. DOI:10.3321/j.issn:0578-1752.2007.12.006 |
| [3] |
KITTIWORAWAT S, YOUPENSUK S, RERKASEM B. Diversity of arbuscular mycorrhizal fungi in Mimosa invisa and effect of the soil pH on the symbiosis[J]. Chiang Mai Journal of Science, 2010, 37(3): 517-527. |
| [4] |
HELGASON B L, WALLEY F L, GERMIDA J J. Fungal and bacterial abundance in long-term no-till and intensive-till soils of the Northern Great Plains[J]. Soil Science Society of America Journal, 2009, 73(1): 120-127. DOI:10.2136/sssaj2007.0392 |
| [5] |
TREONIS A M, AUSTIN E E, BUYER J S, et al. Effects of organic amendment and tillage on soil microorganisms and microfauna[J]. Applied Soil Ecology, 2010, 46(1): 103-110. DOI:10.1016/j.apsoil.2010.06.017 |
| [6] |
曹鹏.典型生态系统土壤微生物分布特征及生态学机制[D].北京: 中国科学院研究生院, 2015 CAO P. Distribution patterns and the ecological mechanisms of soil microorganism in typical ecosystems[D]. Beijing: University of Chinese Academy of Sciences, 2015 http://www.irgrid.ac.cn/handle/1471x/1110451?mode=full&submit_simple=Show+full+item+record |
| [7] |
何玉梅, 张仁陟, 张丽华, 等. 不同耕作措施对土壤真菌群落结构与生态特征的影响[J]. 生态学报, 2007, 27(1): 113-119. HE Y M, ZHANG R Z, ZHANG L H, et al. Effects of different tillage practices on fungi community structure and ecologic characteristics in loess soils[J]. Acta Ecologica Sinica, 2007, 27(1): 113-119. |
| [8] |
YAN F, MCBRATNEY A B, COPELAND L. Functional substrate biodiversity of cultivated and uncultivated A horizons of vertisols in NW New South Wales[J]. Geoderma, 2000, 96(4): 321-343. DOI:10.1016/S0016-7061(00)00018-5 |
| [9] |
李彤, 王梓廷, 刘露, 等. 保护性耕作对西北旱区土壤微生物空间分布及土壤理化性质的影响[J]. 中国农业科学, 2017, 50(5): 859-870. LI T, WANG Z T, LIU L, et al. Effect of conservation tillage practices on soil microbial spatial distribution and soil physico-chemical properties of the northwest dryland[J]. Scientia Agricultura Sinica, 2017, 50(5): 859-870. |
| [10] |
高焕文. 保护性耕作技术与机具[M]. 北京: 化学工业出版社, 2004. GAO H W. Conservation Tillage Technology and Machinery Tools[M]. Beijing: Chemical Industry Press, 2004. |
| [11] |
王碧胜, 蔡典雄, 武雪萍, 等. 长期保护性耕作对土壤有机碳和玉米产量及水分利用的影响[J]. 植物营养与肥料学报, 2015, 21(6): 1455-1464. WANG B S, CAI D X, WU X P, et al. Effects of long-term conservation tillage on soil organic carbon, maize yield and water utilization[J]. Journal of Plant Nutrition and Fertilizer, 2015, 21(6): 1455-1464. |
| [12] |
张贵云, 张丽萍, 魏明峰, 等. 长期保护性耕作对丛枝菌根真菌多样性的影响[J]. 中国生态农业学报, 2018, 26(7): 1048-1055. ZHANG G Y, ZHANG L P, WEI M F, et al. Effect of long-term conservation tillage on arbuscular mycorrhizal fungi diversity[J]. Chinese Journal of Eco-Agriculture, 2018, 26(7): 1048-1055. |
| [13] |
迟凤琴, 刘晶鑫, 匡恩俊, 等. 黑土长期定位试验原状土搬迁对土壤细菌群落多样性的影响[J]. 土壤通报, 2015, 46(6): 1420-1427. CHI F Q, LIU J X, KUANG E J, et al. Effects of black soil long-term test undisturbed soil moved on soil bacterial community diversity[J]. Chinese Journal of Soil Science, 2015, 46(6): 1420-1427. |
| [14] |
李桥.基于高通量测序技术下土壤微生物群落结构的研究[D].济南: 山东师范大学, 2014 LI Q. Research of soil microbial community structure based on high-throughput sequencing technology[D]. Jinan: Shandong Normal University, 2014 http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10445-1014191510.htm |
| [15] |
韩亚飞, 伊文慧, 王文波, 等. 基于高通量测序技术的连作杨树人工林土壤细菌多样性研究[J]. 山东大学学报:理学版, 2014, 49(5): 1-6. HAN Y F, YI W H, WANG W B, et al. Soil bacteria diversity in continuous cropping poplar plantation by high throughput sequencing[J]. Journal of Shandong University:Natural Science, 2014, 49(5): 1-6. |
| [16] |
岳桂东, 高强, 罗龙海, 等. 高通量测序技术在动植物研究领域中的应用[J]. 中国科学:生命科学, 2012, 42(2): 107-124. YUE G D, GAO Q, LUO L H, et al. The application of high-throughput sequencing technology in plant and animal research[J]. Scientia Sinica Vitae, 2012, 42(2): 107-124. |
| [17] |
牛世全, 龙洋, 李海云, 等. 应用Illumina MiSeq高通量测序技术分析河西走廊地区盐碱土壤微生物多样性[J]. 微生物学通报, 2017, 44(9): 2067-2078. NIU S Q, LONG Y, LI H Y, et al. Microbial diversity in saline alkali soil from Hexi Corridor analyzed by Illumina MiSeq high-throughput sequencing system[J]. Microbiology China, 2017, 44(9): 2067-2078. |
| [18] |
VERE D. Research into Conservation Tillage for Dryland Cropping in Australia and China[J]. Canberra:The Australian Centre for International Agricultural Research, 2005, 8-46. |
| [19] |
鲍士旦. 土壤农化分析[M]. 第3版. 北京: 中国农业出版社, 2000. BAO S D. Soil and Agricultural Chemistry Analysis[M]. 3rd ed. Beijing: China Agriculture Press, 2000. |
| [20] |
PITTA D W, PARMAR N, PATEL A K, et al. Bacterial diversity dynamics associated with different diets and different primer pairs in the rumen of Kankrej cattle[J]. PLoS One, 2014, 9(11): e111710. DOI:10.1371/journal.pone.0111710 |
| [21] |
SUN R B, ZHANG X X, GUO X S, et al. Bacterial diversity in soils subjected to long-term chemical fertilization can be more stably maintained with the addition of livestock manure than wheat straw[J]. Soil Biology and Biochemistry, 2015, 88: 9-18. DOI:10.1016/j.soilbio.2015.05.007 |
| [22] |
曹辉, 李燕歌, 周春然, 等. 炭化苹果枝对苹果根区土壤细菌和真菌多样性的影响[J]. 中国农业科学, 2016, 49(17): 3413-3424. CAO H, LI Y G, ZHOU C R, et al. Effect of carbonized apple branches on bacterial and fungal diversities in apple root-zone soil[J]. Scientia Agricultura Sinica, 2016, 49(17): 3413-3424. DOI:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.17.014 |
| [23] |
ZHANG C H, LI S F, YANG L, et al. Structural modulation of gut microbiota in life-long calorie-restricted mice[J]. Nature Communications, 2013, 4: 2163. DOI:10.1038/ncomms3163 |
| [24] |
戴雅婷, 闫志坚, 解继红, 等. 基于高通量测序的两种植被恢复类型根际土壤细菌多样性研究[J]. 土壤学报, 2017, 54(3): 735-748. DAI Y T, YAN Z J, XIE J H, et al. Soil bacteria diversity in rhizosphere under two types of vegetation restoration based on high throughput sequencing[J]. Acta Pedologica Sinica, 2017, 54(3): 735-748. |
| [25] |
厉桂香, 马克明. 土壤微生物多样性海拔格局研究进展[J]. 生态学报, 2018, 38(5): 1521-1529. LI G X, MA K M. Progress in the study of elevational patterns of soil microbial diversity[J]. Acta Ecologica Sinica, 2018, 38(5): 1521-1529. |
| [26] |
李玉洁, 王慧, 赵建宁, 等. 耕作方式对农田土壤理化因子和生物学特性的影响[J]. 应用生态学报, 2015, 26(3): 939-948. LI Y J, WANG H, ZHAO J N, et al. Effects of tillage methods on soil physicochemical properties and biological characteristics in farmland:A review[J]. Chinese Journal of Applied Ecology, 2015, 26(3): 939-948. |
| [27] |
DOLAN M S, CLAPP C E, ALLMARAS R R, et al. Soil organic carbon and nitrogen in a Minnesota soil as related to tillage, residue and nitrogen management[J]. Soil and Tillage Research, 2006, 89(2): 221-231. DOI:10.1016/j.still.2005.07.015 |
| [28] |
FILHO C C, LOURENÇO A, DE F GUIMARÃES M, et al. Aggregate stability under different soil management systems in a red latosol in the state of Parana, Brazil[J]. Soil and Tillage Research, 2002, 65(1): 45-51. DOI:10.1016/S0167-1987(01)00275-6 |
| [29] |
杨培培, 杨明欣, 董文旭, 等. 保护性耕作对土壤养分分布及冬小麦吸收与分配的影响[J]. 中国生态农业学报, 2011, 19(4): 755-759. YANG P P, YANG M X, DONG W X, et al. Effect of conservation tillage on wheat and soil nutrient distribution and absorption[J]. Chinese Journal of Eco-Agriculture, 2011, 19(4): 755-759. |
| [30] |
李友军, 黄明, 吴金芝, 等. 不同耕作方式对豫西旱区坡耕地水肥利用与流失的影响[J]. 水土保持学报, 2006, 20(2): 42-45. LI Y J, HUANG M, WU J Z, et al. Effects of Different Tillage on utilization and run-off of water and nutrient in sloping farmland of Yuxi dryland area[J]. Journal of Soil and Water Conservation, 2006, 20(2): 42-45. DOI:10.3321/j.issn:1009-2242.2006.02.011 |
| [31] |
戴亮.耕作方式对土壤微生物及土壤腐殖质影响的研究[D].长春: 吉林农业大学, 2012 DAI L. Tillage practices on soil microbes and soil humus impact[D]. Changchun: Jilin Agricultural University, 2012 http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10193-1013127113.htm |
| [32] |
许菁, 李晓莎, 许姣姣, 等. 长期保护性耕作对麦-玉两熟农田土壤碳氮储量及固碳固氮潜力的影响[J]. 水土保持学报, 2015, 29(6): 191-196. XU J, LI X S, XU J J, et al. Effects of long-term conservation tillage on soil organic carbon and nitrogen storages, soil carbon sequestration potential and nitrogen fixation potential in wheat-maize crop system[J]. Journal of Soil and Water Conservation, 2015, 29(6): 191-196. |
| [33] |
王克鹏, 张仁陟, 董博, 等. 长期保护性耕作对黄土高原旱地土壤水分及作物叶水势的影响[J]. 生态学报, 2014, 34(13): 3752-3761. WANG K P, ZHANG R Z, DONG B, et al. Effect of long-term conservation tillage on soil water regimes and leaf water potential of crops in rainfed areas of the Loess Plateau[J]. Acta Ecologica Sinica, 2014, 34(13): 3752-3761. |
| [34] |
郁鑫, 王旭东. 黄土高原不同耕作方式对土壤理化性质及作物产量的影响[J]. 安徽农业科学, 2018, 46(5): 144-146. YU X, WANG X D. Effects of different tillage methods on soil physical-chemical properties and crop yield in Loess Plateau[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences, 2018, 46(5): 144-146. DOI:10.3969/j.issn.0517-6611.2018.05.043 |
| [35] |
严洁, 邓良基, 黄剑. 保护性耕作对土壤理化性质和作物产量的影响[J]. 中国农机化, 2005(2): 31-34. YAN J, DENG L J, HUANG J. Effect of conservation tillage on soil physicochemical properties and crop yields[J]. Chinese Agricultural Mechanization, 2005(2): 31-34. DOI:10.3969/j.issn.1006-7205.2005.02.010 |
| [36] |
李娟.渭北旱塬玉米田轮耕下土壤质量及生产性能响应研究[D].杨凌: 西北农林科技大学, 2017 LI J. Research on soil quality and production capability under rotation tillage on maize field in Weibei highland[D]. Yangling: Northwest A & F University, 2017 http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10712-1017100363.htm |
| [37] |
赵洪利, 李军, 贾志宽, 等. 不同耕作方式对黄土高原旱地麦田土壤物理性状的影响[J]. 干旱地区农业研究, 2009, 27(3): 17-21. ZHAO H L, LI J, JIA Z K, et al. Effect of different tillages on soil physical properties of dryland wheat field in the Loess Plateau[J]. Agricultural Research in the Arid Areas, 2009, 27(3): 17-21. |
| [38] |
DUNBAR J, BARNS S M, TICKNOR L O, et al. Empirical and theoretical bacterial diversity in four Arizona soils[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2002, 68(6): 3035-3045. DOI:10.1128/AEM.68.6.3035-3045.2002 |
| [39] |
ROESCH L F W, FULTHORPE R R, RIVA A, et al. Pyrosequencing enumerates and contrasts soil microbial diversity[J]. The ISME Journal, 2007, 1(4): 283-290. DOI:10.1038/ismej.2007.53 |
| [40] |
刘洋, 曾全超, 黄懿梅. 基于454高通量测序的黄土高原不同乔木林土壤细菌群落特征[J]. 中国环境科学, 2016, 36(11): 3487-3494. LIU Y, ZENG Q C, HUANG Y M. Soil microbial communities by 454prosequencing under different arbor forests on the Loess Plateau[J]. China Environmental Science, 2016, 36(11): 3487-3494. DOI:10.3969/j.issn.1000-6923.2016.11.035 |
| [41] |
LIU J J, SUI Y Y, YU Z H, et al. High throughput sequencing analysis of biogeographical distribution of bacterial communities in the black soils of northeast China[J]. Soil Biology and Biochemistry, 2014, 70: 113-122. DOI:10.1016/j.soilbio.2013.12.014 |
| [42] |
DORAN J W. Soil microbial and biochemical changes associated with reduced tillage[J]. Soil Science Society of America Journal, 1980, 44(4): 765-771. DOI:10.2136/sssaj1980.03615995004400040022x |
| [43] |
LIU X, LINDEMANN W C, WHITFORD W G, et al. Microbial diversity and activity of disturbed soil in the northern Chihuahuan Desert[J]. Biology and Fertility of Soils, 2000, 32(3): 243-249. DOI:10.1007/s003740000242 |
| [44] |
BENDING G D, TURNER M K, JONES J E. Interactions between crop residue and soil organic matter quality and the functional diversity of soil microbial communities[J]. Soil Biology and Biochemistry, 2002, 34(8): 1073-1082. DOI:10.1016/S0038-0717(02)00040-8 |
| [45] |
王伏伟, 王晓波, 李金才, 等. 施肥及秸秆还田对砂姜黑土细菌群落的影响[J]. 中国生态农业学报, 2015, 23(10): 1302-1311. WANG F W, WANG X B, LI J C, et al. Effects of fertilization and straw incorporation on bacterial communities in lime concretion black soil[J]. Chinese Journal of Eco-Agriculture, 2015, 23(10): 1302-1311. |
| [46] |
罗培宇.轮作条件下长期施肥对棕壤微生物群落的影响[D].沈阳: 沈阳农业大学, 2014 LUO P Y. Effect of long-term fertilization on microbial community in a brown soil under crop-rotation system[D]. Shenyang: Shenyang Agricultural University, 2014 http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10157-1014295053.htm |